球结合的靶物质就会被磁场滞留,从而与其他复杂物质分离开来。
用于细胞分离的免疫磁性微球具备以下条件:化学性能稳定,不产生凝聚;不与细胞发生非特异性的结合;磁性微球与抗体的结合牢固;磁性微球的大小均匀,磁响应性好,磁性纳米材料的含量均匀一致;磁性微球大小适当,不易被细胞所吞噬。
IMM与细胞的结合可以采取两种方法,直接法和间接法。直接法是指抗体直接连在磁性微球上,然后与靶细胞结合。间接法是指先将细胞与特异抗体混合培养,使特异抗体结合在细胞表面,然后加入预先用抗鼠IgG(二抗)处理的磁性微球。使磁性微球间接地与靶细胞结合。直接法可以减少洗涤和培养步骤,但对IgM单抗很少能使用。间接法与直接法相比,除适当范围广外,还可以使用一组单克隆抗体,因而会获得更好的细胞清除效果。但要经过多次的洗涤步骤,特异性也会有所降低。
针对单核细胞的单克隆抗体的发展使得分离带有特异表面标记的细胞成为可能。一般有3类不同的方法,即流式细胞仪技术(PACS)、表面联上二抗的异体红细胞花环技术、将抗体被动吸附在聚苯乙烯组织养板上的Panning技术。这些技术都有各自的缺点。FACS价格昂贵,技术复杂
,经常会被所分选细胞的容量、活性、无菌度等问题所困扰;红细胞花环技术无法处理大量的细胞,另外,至今尚无一成熟、简便的方法能够将抗体偶联至红细胞膜上;Panning技术也有很多局限性,它难与放大操作,步骤烦琐,不能定量,靶细胞经常混杂着非特异抗体吸附在培养板底部的其他细胞。相对而言,免疫磁性微球具有操作简便、分离迅速完全、细胞纯度高等优点,尤其在操作简便省时方面,其他分离方法很难比拟。
4 免疫磁性微球在生物医学方面的应用
(1)免疫磁性微球在自身骨髓移植中的应用 在过去10多年中,高剂量化疗后给予自身骨髓移植(ABMT)已经成为某些患有急性白血病、何杰金氏淋巴瘤(NHL)、神经母细胞瘤及wilms肿瘤的可选疗法。最近,ABMT用于小细胞肺癌、睾丸癌和乳腺癌也取得了饿令人鼓舞的结果。但是,ABMT也有限制条件,那就是肿瘤转移细胞有可能累及骨髓。因此,在体外清除骨髓中的癌细胞是保证ABMT成功的必要条件。体外净化骨髓已发展起来多种方法。其中,运用免疫磁性微球物理地清除癌细胞的方法具有安全、效果好、操作简单的特点,得到广泛应用。免疫磁性微球技术发展起来的原因之一,就是越来越多的证据表明,肿瘤细胞亚类可以排斥补体介导的细胞溶解反应。而IMMS净化骨髓不需要特异的ISOTYPE抗体,也不受正常骨髓中抗补体因子的影响,可以清除低水平抗原表达的肿瘤细胞。自免疫磁性微球问世以来,至今已经应用于几乎所有的需要进行骨髓净化的癌症类型。如神经母细胞、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小细胞癌、乳腺癌等[76]。
①用于清除神经母细胞瘤细胞 IMMS最早应用于神经母细胞瘤细胞的清除。1984年,Treleaven等人建立了运用IMMS从骨髓中清除癌细胞的模型系统。清除过程为:将磁性微球与IgG1族的6个单克隆抗体(UJ13A、UJ223.8、UJ127.11、UJ181.4、Thy-1和H11)在4℃、转动状态培养2h后,混合物放在传送装置上通过一系列的磁场。则神经母细胞瘤细胞被滞留,“干净”的骨髓自然流下。结果表明,在有核骨髓细胞中混有1%的神经母细胞瘤细胞(cell
line CHP100)时,用IMMS可清除99.9%的肿瘤细胞。而对正常细胞的损害极小,通过分离装置后,细胞的活性超过了98%。聚落分析证明,BFU-E、CFU-C、CFU-GEM和CFU-E均无显著降低。
②用于清除淋巴瘤细胞 De Rosa等人将IMMS应用于2例淋巴瘤病人的自身骨髓移植。首先,将骨髓与4种单克隆抗体(CD10、CD19、CD20、CD22)一起培养,再与包有二抗的磁性微球一起培养,最后通过分离装置。微球与靶细胞比例为50:1。清除后,单核细胞的恢复率分别为56%和40%,CFU-GM恢复率分别为45%和38%。两例病人移植顺利并无并发症。1例4个月后复发,另1例在5个月后依然处于缓解期。实验证明,应用免疫磁性微球在自身骨髓移植前清除癌细胞是一种安全、简单、可重复的技术。
Combaret等人建立了应用免疫磁性微球净化感染了Bmrkitt淋巴瘤或神经母细胞瘤的骨髓移植的模型系统。能够可重现地清除3~4个对数级的恶性细胞,此结果与应用Burkitt淋巴瘤的补体溶解方法所得类似。对123例患神经母细胞的儿童病人在自身骨髓移植时应用免疫磁性微球进行骨髓净化,结果表明:该过程会导致单核细胞的显著损失,但对骨髓造血细胞五毒。病人表现出严重的T细胞缺陷,在