stad更发展了应用免疫磁珠的直接分型方法。在磁珠上连接抗人多态型HLA决定族,通过评价细胞和磁珠之间形成花环的程度来直接进行分型。
d.分离其他细胞 免疫磁珠在从血液中分离、定量、分型各细胞亚类方面的应用与日聚增。Brinchmann等设计了一种快速、直接从血中定量各个淋巴细胞亚类绝对数目的方法。用免疫磁珠分离CD2+,CD4+,CD8+,CD9+后用血球计数板测定形成花环的比例。Brinchmann同时应用免疫磁珠成功地从自然感染的CD4+细胞中分离出了人类免疫缺陷病毒(HIV),并发现活化的CD8+细胞对自然感染的CD4+细胞中的HIV复制抑制因子。Egeland等用连有免疫复合物的免疫磁珠从外周血中分离产生类风湿因子的B淋巴细胞。获得了104~106倍富集的特异性B细胞。分离后,B细胞直接用Epstein-Barr病毒转化,大量扩增,随后检测抗体的产生情况。这项技术可以用来生产单克隆抗体。从单一的抗原特异B淋巴细胞群开始可以增加克隆成功的机会并提高杂交后相关杂合体的几率。Ossendorp等用连有Thyroglobulin的免疫磁珠来与B细胞杂交瘤系形成花环,T
hroglobulin特异细胞浓集了300倍。其他的应用还包括分离滋养层细胞、嗜酸性细胞、郎罕氏细胞、NK细胞、内皮细胞等等。
②分离细胞器 传统上,分离细胞器都是基于细胞器大小和密度的差异,在细胞匀浆后应用密度梯度离心来实现的。但是,许多平滑膜泡没有密度差异,很难用此方法分开。另外,许多新发展起来的细胞和分子生物学技术必须用体外培养的细胞。这些细胞往往不易匀浆。应用免疫磁珠技术则可避免种类缺陷。在海得堡的欧洲分子生物实验室(EMBL)发展了一种应用免疫磁珠分离细胞器的“磁性自由流式系统”(Magnetic
Free Flow Systen,MFFS),在整个分离和后续洗涤过程中,磁珠始终分散在整个稀释悬浮液中。调节磁场至一个合适的强度,使洗涤液自由流下的同时磁珠及其吸附物维持于瓶中,这种方式可以避免对所要分离的膜泡的损伤,因为它省去了反复浓集和重新悬浮的过程。EMBL用一对简单的抗原/抗体模型对MFFS的条件进行了优化,结果表明,他相对于传统的分离方法具有受率高、非特异吸附少、对结合物损伤小等优点。他们用此方法进行了高尔基体、内质网等的分离。
③在微生物学上的应用 免疫磁珠在微生物学上也有广泛的用途,通过免疫反应结合于磁珠上的微生物通常可保持活性,提供给适当的营养就可以大量扩增。过程一般是将免疫磁珠与样品混合,培养10~30min,外加磁场提取结合有活微生物的磁珠。在注入合适的培养基前可以进行洗涤,单抗和多抗都可以应用。免疫磁珠技术有很多优点:将靶细菌从环境中分离出来,从很大的体积浓集至适于培养的体积;将样品中的生长抑制因子从细菌中清除去,有利于细菌的生长;当样品中既有病原菌,又有大量非致病性变种时,选择性培养基在分离靶生物时经常无能为力,而免疫磁珠在选择性分离拥有与致病力有关的特异抗原决定族的菌种方面具有很大的潜力。
结合于磁珠上的细菌可以直接在显微镜下进行分析,如对脆弱链泡囊菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌等的检测;也可以与其他检测方法结合起来进行分析。Cudjoe等首先用免疫磁珠分离出培养基和临床样品中的毒素,然后在免疫磁珠上直接用ELISA(LMB-ELISA)进行检测,他建立了用IMB-ELISA检测事物中的沙门氏杆菌的系统,对于热处理后的熟食品,增菌后的培养中仅含微量竞争肠道菌群,浓缩后可直接用IMB-PCR进行检测;对于未经过热加工的生食品,其中含有较多的竞争微生物,要先用免疫磁珠进行分离,然后在方法的全部检测时间,包括制样时间在内不超过26h。最低检测限可达105/ml样品。阳性率高于ISO,IMS-Plating,Salmonella-Tek
ELISA 等方法。Bennet等则对用IMB-ELISA分离检测食品中的大肠杆菌O157进行了评价。
而越来越多的人将免疫磁珠技术与PCR结合起来,称为IMB-PCR技术。影响PCR直接应用于临床诊断的一个因素是样品中的细菌浓度。另外,冻存过的样品中可能包含死菌,不适合培养,而应用PCR则可以很好地进行检测。应用IMB-PCR进行检测的微生物包括:牙龈卟啉单孢菌、小肠结肠炎耶尔菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等。Grindede等则将免疫磁珠和转录PCR(RT-PCR)结合起来用以检测环境样品中的A型反转录病毒。最近,Lvdnerbrg等人运用免疫磁珠设计了一种固相分析技术,通过比色来检测DNA,称作固定型放大了一种固定型放大核酸检测(Dectectio