磁性纳米材料制备的免疫磁性微球在生物医学方面的应用

技术分类: 工程材料    作者:东方网  发表时间:2007-10-24
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    of Immobilized Amplifiend Nueleic Acid,DIANA)。运用这种技术可以省略去通常为排除背景干扰所要进行的电脉、内切酶谱、杂交等步骤。如果在靶区加入内标乳糖朝操纵子,然后同时扩增,即可进行定量分析。


  最近,市场上出现了一种将免疫磁珠和电化学发光传染器(IMB-ECL)结合起来的自动检测系统ORIGEN,首先用免疫磁珠捕获靶物质,再用夹心的方法联上钌的三(二吡啶)螯合物Ru(bpy)2+3标记的rporter抗体,用磁场浓集后用电压激发出电化学发光。Gatto等用它来检测各种生物毒素和细菌芽孢,分析A型肉毒杆菌毒素、霍乱β亚基、蓖麻毒素、葡萄球菌内毒素B等的检测限可达fenmtogran
    (10-15g)。分析炭疽杆菌芽孢时,可检测到100个芽孢。


④分子生物学上的应用  应用于分子生物学上的磁性微球表面不是连接抗体,而是连接亲和素,通过亲和素-生物素反应与靶核酸相连。原理与免疫磁珠相似,只不是过将抗原-抗体反应换为配体-配基反应,可以称作亲和磁珠。亲和

素-生物素之间的结合力非常强(Kd=10-15),有利于操作。解链、提取、杂交(用碱或升温)等都不会干扰DNA和磁珠之间的连接。为将生物素插入DNA链中,可以来用生物素化的引物或用Klenow聚合酶和生物素化的核苷酸进行末端标记。亲和磁珠在分子生物学上的应用可归纳于下面几个方面[80]。


a.纯化DNA结合蛋白  连接有特异核苷酸序列的亲和磁珠与样品反应,提取出结合蛋白,再加入高盐溶液就可以将纯化蛋白洗脱下来,磁珠可以反复使用。Gabrielsen等用亲和磁珠纯化DNA结合蛋白(酪母转录因子ⅢC),通过磁性分离,洗涤和洗脱,可以得到高纯蛋白,三次吸附过程仅用1h。


b.纯化PolyA+mRNA  将PolyT直接共价连接于或通过亲和素-生物素连接于磁性微球上即可用于分离PolyA+mRNA,分离后的mRNA可以用洗脱液或加热的方法解离下来。优点是不应用可能发生堵塞的柱子,终体积的终浓度可以控制。


C.DNA序列分析  将亲和磁珠和PCR结合起来可以进行DNA测序。这种方法特别适于自动化,可以很快地制备大量样品,供应给装有加热/冷却系统的工作站进行测序。已经应用于巨细胞病毒、沙眼衣原体、恶性疟原虫、HIVI型病毒,人类基因等。


d.固相克隆  应用亲和磁珠的固相克隆可以克隆任何片断、任何位点,不需限制性内切酶和连接酶,可以得到较高收率的重组片断。用此方法从人染色体克隆人类啊朴脂蛋白E基因片断,可以获得90%以上的正确重组体。


e.体外诱变  体外诱变有很多方法,大部分采用核苷酸介导的诱变,可以使DNA特定部位精确改变。Hultman等描述了一种运用磁性分离技术的体外诱变方法。这种诱变方法的优越性是无论用否PCR均可得到相同的结果,考虑到在克隆PCR产品时,累计聚合酶错误是一个必须注意的问题,这种用非PCR方法获得vector的固相方法非常有吸引力。另外,磁珠还用于单链DNA探针的标记和genomic
    Walking等。


用免疫磁珠清除自身免疫型精子  Foresta、Shulmand等应用免疫磁性微球来清除自身免疫不育病患者精液中带有自身抗体的精子,希望有净化的精子进行体外或受精来治疗自身免疫不育症。Vigano发现,这种方法可以清除掉50%的IgL标记的精子,精子运动和完整性实验证明磁珠对精子的性质没有影响。Ohashi等则用免疫磁珠进行了分离顶体反应精子的尝试。

⑥用IMB-PCR检测循环系统中的癌细胞

  血液是癌扩散的一个重要途径,对血液中癌细胞的检测可能成为临床医生预测癌症复发、选择更加合适的辅助治疗方法的重要工具。Hardingham等发展了用IMB-PCR来检测血液中分离出癌细胞,用PCR-RFLP检测细胞k-ras基因的第12密码子的突变情况。可以重复地检测出样品中小于10pg的DNA(〈lcell〉。在随后的临床实验中,用此方法对27例编码突变病人的血液进行了检测。9例发现有癌细胞的病人中,7人因为复发后转移而死亡。其余18例发现有癌细胞的病人中,16人没有复发(中期检查:16个月,范围7~42个月)。Kaplan-Meier分析表明血液中K-ras突变细胞的检测结果与无病存活期显著相关(p=0.0001)。Mass等则用IHB-RT-PCR对人乳腺癌细胞中广谱抗药基因1(MDR1)的信使RNA水平进行了检测。












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